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Cell | 利用CRISPRi与单细胞测序在人类红白血病细胞系中绘制基因调控图谱

撰文丨兮

责编丨迦溆

近年来,针对于人类基因组的研究比如GWAS (genome-wide association study,全基因组关联分析),eQTL(expression quantitative trait locus, 表达数量性状座位)等研究呈爆发式增长,这些研究为我们带来了海量的未知数据,其中最重要的一种数据就是候选调控元件。目前,在人类基因组中已经发现的候选调控元件超过了100万个,但是绝大部分没有经过功能验证以及其靶基因不明确。因此验证这些调控元件的功能,探索其靶点基因,揭示其关联性状是当下亟需解决的问题。

受限于大范围的常见突变(SNP)和连锁不平衡的分辨率,以往的研究不能够充分地揭示这些调控元件的功能。虽然2015-2017三年间,有很多团队包括本文研究者曾采用了一种单细胞水平上的CRISPR/Cas9技术来评估候选调控序列【1-3】,但是受限于:(1)只筛查了特定基因;(2)单个细胞中只感染一种gRNA,该方法并不能很清晰地剖析这些调控元件的功能。

近日,来自美国西雅图霍华德·休斯医学研究所的Jay Shendure教授及其团队在Cell杂志上发表了题为A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens的论文【4】,开发了一种基于CRISPRi结合scRNA-seq (single-cell RNA sequencing,单细胞测序)的方法,利用单细胞测序和在单细胞中感染gRNA突破上述局限性,在K562细胞系(一种慢性髓系白血病细胞系)中鉴定出了664个顺式增强子。研究者强调这一框架图谱将有助于大规模研究增强子-基因的相互作用和重要但未知的顺式调控元件。

首先,研究者在K562细胞(人类红白血病细胞系)中选取了位于基因间DNase I超敏区域的1,119个增强子,并针对每一个增强子设计了2个gRNA,利用慢病毒将这些gRNA库转入K562细胞中,经过培养后选取了47,650个成功转染的单细胞并进行转录组分析。经过生物信息学分析后,鉴定出了145对增强子-基因相互作用关系。接下来,研究者扩大候选增强子数量至5,779个,相应的细胞也增加到了207,342个,使用同样的方法发现了664对增强子-基因相互作用关系。为了验证该方法的准确性,研究者选取了PRKCB、GYPC、NMU三个基因和其转录起始位点上游的增强子以及PTGER3转录起始位点下游的增强子(这四个基因的共同点是具有多个增强子)进行了验证,明确了这些增强子敲除对基因表达的影响。接下来研究者比对了与K562相关的169个5ChIP-seq数据,发现两者之间并没有很好的关联性。同时还比对了K562的Hi-C6数据,发现仅有少数增强子与基因在空间上是接近的。

虽然该方法仍有一定的局限性,但是这项工作为研究人类基因组上增强子与其靶基因的关系提供了新的角度,同时也有助于鉴别更多的增强子与基因对。

原文链接:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741831554X

参考文献

1. Canver, M.C., Smith, E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., et al. (2015). BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197.

2. Fulco, C.P., Munschauer, M., Anyoha, R., Munson, G., Grossman, S.R., Perez, E.M., Kane, M., Cleary, B., Lander, E.S., and Engreitz, J.M. (2016). Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science 354, 769–773.

3. Gasperini, M., Findlay, G.M., McKenna, A., Milbank, J.H., Lee, C., Zhang, M.D., Cusanovich, D.A., and Shendure, J. (2017). CRISPR/Cas9-mediated scanning for regulatory elements required for HPRT1 expression via thousands of large, programmed genomic deletions. Am. J. Hum. Genet. 101, 192–205.

4. Molly Gasperini, Andrew J. Hill, Jose′ L. McFaline-Figueroa, ..., Cole Trapnell, Nadav Ahituv, Jay Shendure. (2019). A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens. Cell.

5. ENCODE Project Consortium (2012). An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature 489, 57–74.

6. Rao, S.S.P., Huntley, M.H., Durand, N.C., Stamenova, E.K., Bochkov, I.D., Robinson, J.T., Sanborn, A.L., Machol, I., Omer, A.D., Lander, E.S., and Aiden, E.L. (2014). A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell 159, 1665–1680.

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